TEKNIK BIOKIMIA

 

Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi.  Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri. Struktur sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Hal inilah yang menjadi dasar perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks (Colome, 2001).

Uji biokimia merupakan salah uji yang digunakan untuk menentukan spesies bakteri yang tidak diketahui sebelumnya. Setiap bakteri memiliki sifat biokimia yang berbeda sehingga tahapan uji biokimia ini sangat membantu proses identifikasi. Setelah sampel diinokulasikan pada media differensial atau selektif, kemudian koloni bakteri diinokulasikan pada media uji biokimia. Ada 12 jenis uji yang sering digunakan dalam uji biokimia walaupun sebenarnya masih banyak lagi media yang dapat digunakan (Adam, 2001). Pentingnya dilakukan praktikum ini adalah untuk melakukan teknik identifikasi dan karakterisasi jenis bakteri melalui uji biokimia.

Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi melalui sifat - sifat fisiologinya. Proses biokimia erat kaitannya dengan metabolisme sel, yakni selama reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi maupun yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan selular, seperti pergerakan. Suatu bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, sehingga perlu diteliti sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya. Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tidak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pegamatan fisiologis yang memadai mengenai kandungan organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakterisasi dan klasifikasi sebagian mikroorganisme seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik maupun biokimia.  Mikroorganisme dapat tumbuh pada beberapa tipe media yang memproduksi tipe metabolit yang dapat dideteksi dengan reaksi antara mikroorganisme dengan reagen test yang dapat menghasilkan perubahan warna reagen (Cowan, 2004).

2.1 Uji Indol

Media yang dipakai adalah pepton 1%. Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim triptophanase sehingga bakteri tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan membentuk indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan reagen Ehrlich/Kovac’s yang berisi paradimetil amino bensaldehid. Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon. Positif (+) : Terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini membentuk indol dari triptophan sebagai sumber karbon(Cowan, 2004).

2.2 Uji MR

Media yang digunakan adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini digunakan untuk mengetahui adanya fermentasi asam campuran (metilen glikon). Interpretasi hasil : negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambah methyl red 1%. Positif (+) : Terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan methyl red 1%. Artinya bakteri menghasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam media MR (Cowan, 2004).

2.3 Uji VP

Media yang dipakai adalah pepton glukosa phosphat. Uji ini digunakan untuk mengetahui pembentukan asetil metil karbinol (asetoin) dari hasil fermentasi glukosa. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan a naphtol 5% dan KOH 40%. Positif (+) : terjadi perubahan warna media menjadi merah setelah ditambahkan a naphtol 5% dan KOH 40%, artinya hasil akhir fermentasi bakteri adalah asetil metil  karbinol (asetoin) (Colome, 2001).

2.4 Uji Citrat

Media yang dipakai adalah Simons citrat. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB (Brom Tymol Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga bakteri tidak menggunakan citra  sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon. Positif (+) : terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya bakteri menggunakan citrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon (Ratna, 2012).

2.5 Uji Motilitas

Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan kandungan agar-agar 0,2-0,4%. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak bakteri, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin) atau SIM (Sulfida Indol Motility). Pada media SIM selain untuk melihat motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H2S. Interpretasi hasil : negatif (-) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar hanya pada bekas tusukan  inokulasi. Positif (+) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel (Burrows, 2004).

2.6 Uji Urenase

Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim urease yang dapat menguraikan urea membentuk amoniak. Media urea berisi indikator phenol red. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi pink/merah jambu, artinya bakteri tidak memecah urea membentuk amoniak. Positif (+) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi pink/merah jambu, artinya bakteri memecah urea membentuk amoniak (Lim, 2006).

 2.7 Uji Motilitas

Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan kandungan agar-agar 0,2-0,4%. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak bakteri, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin) atau SIM (Sulfida Indol Motility). Pada media SIM selain untuk melihat motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H2S. Interpretasi hasil : negatif (-) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar hanya pada bekas tusukan  inokulasi. Positif (+) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel (Burrows, 2004).

2.8 Uji Urenase

Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim urease yang dapat menguraikan urea membentuk amoniak. Media urea berisi indikator phenol red. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi pink/merah jambu, artinya bakteri tidak memecah urea membentuk amoniak. Positif (+) : tidak terjadi perubahan warna media menjadi pink/merah jambu, artinya bakteri memecah urea membentuk amoniak (Lim, 2006).

2.9 Uji TSA (Triple Sugar Iron Agar)

Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah phenol red yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa berada di bagian lereng. Selain menggunakan media TSIA dapat pula digunakan media KIA (Kligers Iron Agar), bedanya adalah pada media KIA hanya berisi 2 macam karbohidrat yaitu glukosa dan laktosa. Interpretasi hasil : hanya memfermentasi glukosa : Bila pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa) ? Al/Ac atau K/A. Memfermentasi semua karbohidrat : bila pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna kuning (bersifat asam) ? Ac/Ac atau A/A. Tidak memfermentasi semua karbohidrat : bila pada dasar (butt) media berwarna merah (bersifat basa) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa) ? Al/Al atau K/K. Fermentasi pada TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2 yang dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Media TSIA juga dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H2S yaitu melihat apakah bakteri memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai gugus S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika bakteri memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar dan gugus S akan bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+ membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap (Buchanan, 2003). 

2.10 Uji Gula-gula

Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah bakteri memfermentasi masing-masing gula diatas membentuk asam. Media gula-gula ini terpisah dalam 5 tabung yang berbeda dan media yang digunakan adalah masing-masing gula dengan konsentrasi 1% dalam pepton. Masing-masing gula gula ditambahkan indikator phenol red. Interpretasi hasil : negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning, artinya bakteri tidak memfermentasi gula .Positif (+) : terjadi perubahan warna media kudari merah menjadi kuning. Artinya bakteri memfermentasi gula membentuk ditandai dengan tinta pada tutup kapas yang berbeda-beda. Untuk glukosa tidak berwarna, laktosa berwarna ungu, maltosa berwarna merah, manitol berwarna hijau, dan sukrosa berwarna biru. Didalam media gula- asam, positif + gas (+g) : Terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning. Artinya bakteri memfermentasi gula membentuk asam dan gas. Gas yang diperhitungan minimal 10% dari tinggi tabung durham (Adam, 2001)